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PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)的問題及解決辦法

點(diǎn)擊次數(shù):1644 日期:2015/6/13 15:27:35

PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)的問題及解決辦法
    在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),京城會(huì)遇到一些問題,需要改變各種影響PCR擴(kuò)增的參數(shù)及條件,以改善反應(yīng)產(chǎn)物的常量和特異性。
1、沒有得到所希望的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
       確定是加入酶,檢查酶是否具有活性。
       DNA分子解鏈?zhǔn)欠癯浞帧⑼耆?/div>
       加入的人工合成引物是否爭(zhēng)取。
       在未加入Taq DNA聚合酶之前,將反映系統(tǒng)放置在95℃保溫5-10分鐘,以使蛋
         白酶及核酸酶失去活性
2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠電泳中呈片狀。
   減少Taq DNA聚合酶的濃度。
   增加退火的溫度
   降低Mg++的濃度。
   減少擴(kuò)增循環(huán)周期次數(shù)。
   減少退火及延伸的時(shí)間。
   從凝膠中回收與所希望的DNA片段大小相同的DNA,再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
3、凝膠電泳中出現(xiàn)引物二聚體區(qū)帶
   ①檢查引物的3`-端是否互補(bǔ)。
   ②設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的引物。
   ③增加靶目標(biāo)DNA的量。
   ④降低引物的濃度。
   ⑤減少擴(kuò)增循環(huán)周期次。
   ⑥增加退火的溫度
4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性不夠
   ①增加退火的溫度。
   ②減少退火及延伸時(shí)間。
   ③降低引物和Taq  DNA聚合酶的濃度。
  ④改變Mg++的濃度
預(yù)防PCR擴(kuò)增中污染的措施:
  1、擴(kuò)增所用的試驗(yàn)要少量分裝保存,最好為一次實(shí)驗(yàn)的使用。
  2、實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)人員要穿工作服、戴手套,尤其是RT-PCR擴(kuò)增的過程中必須戴手套。
  3、實(shí)驗(yàn)中加取標(biāo)本和反應(yīng)試劑要迅速、準(zhǔn)確、盡量減少標(biāo)本取樣的次數(shù),并就近操作,避免遠(yuǎn)距離一樣,陽性對(duì)照最后加入。
  4、PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中所使用的器械要專用,不可竄用。
  5、實(shí)驗(yàn)中使用的加樣頭,標(biāo)本處理和擴(kuò)增用的離心管要高壓滅菌消毒。
  6、加權(quán)樣本和擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí),不要反復(fù)抽吸和空吸,避免產(chǎn)生氣溶膠,污染實(shí)驗(yàn)室。
  7、要嚴(yán)格執(zhí)行先加入反映實(shí)際,后加入標(biāo)本DNA。
  8、擴(kuò)增過程中的流程要有次序,避免已經(jīng)入下步驟的擴(kuò)增標(biāo)本,返回到前一步驟,造成污染。
PCR擴(kuò)增過程中污染的主要來源
核算擴(kuò)增是一項(xiàng)很有效的技術(shù),但同時(shí)優(yōu)勢(shì)很靈敏的方法以至于很容易出現(xiàn)假陽性的反應(yīng),這種假陽性反應(yīng)的干擾主要產(chǎn)生于3個(gè)方面
  1、應(yīng)用DNA質(zhì)粒作為核算擴(kuò)增反應(yīng)的陽性對(duì)照。
  2、DNA由林勇標(biāo)本,培養(yǎng)物或由被污染的試劑延續(xù)下來。
  3、擴(kuò)增DNA的污染(即PCR產(chǎn)物)。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染的主要排出方法:
補(bǔ)骨脂類:
補(bǔ)骨脂類過去主要用于治療牛皮癬。其可悲紫外線火花并嵌入DNA分子中,抑制堿基配對(duì)。
補(bǔ)骨脂類從反應(yīng)開始既包含于PCR混合物在熱循環(huán)液中,擴(kuò)增之后未打開的反應(yīng)關(guān)用紫外線處理之。這種處理使補(bǔ)骨脂素嵌入新行程DNA分子中,并破壞了被處理的DNA重新擴(kuò)增的可能性。但有一個(gè)缺點(diǎn)是增加補(bǔ)骨脂素的量影響DNA在瓊脂糖凝膠中涌動(dòng)以致給出一個(gè)比預(yù)期要高的分子量,還有,補(bǔ)骨脂素處理過的DNA嵌入溴化乙錠不如未處理的DNA好。以致染色減弱,然而以內(nèi)探針?biāo)〉玫碾s交限號(hào)則似因補(bǔ)骨脂素的處理二周明顯的影響。
高濃度的補(bǔ)骨脂素可以輕度以致PCR擴(kuò)增反應(yīng),加入10%甘油能夠克服這個(gè)問題。

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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