影響紙片擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗結(jié)果的因素及其常見誤差的原因

    1959年Kirby-Bower用試管法和紙片法檢查 2000余株葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)試管法測出的抗菌藥物的MIC與紙片法測出的菌株環(huán)直徑密切相關(guān)，并在此基礎(chǔ)上制定捷世其結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)表。

1972年美國食品與藥品管理委員（FDA）和國家臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCIS）推薦紙片法擴(kuò)散試驗作為藥敏的常規(guī)方法，主要用于需氧菌及生長快的兼性需氧管。

在紙片擴(kuò)散的過程中，同時存在細(xì)菌生長和抗菌素擴(kuò)散形成的梯度濃度兩種力量之間的對抗，兩種力量可收到不同因素的影響，必須認(rèn)識這些因素，并加以控制，才能保證結(jié)果的正確。

影響紙片藥敏試驗結(jié)果的因素

1、培養(yǎng)基 應(yīng)不含看菌藥物及拮抗物質(zhì)，蛋白胨中含氨基苯磺酸可使磺胺嘧啶中和，含葉酸代謝產(chǎn)物可使TMP作用時效。不含蛋白胨的牛肉浸液瓊脂平皿可獲得大二清晰的抑菌環(huán)，無胨牛肉浸液瓊脂加入溶解的人血、馬血或兔血則可使抑菌換更清晰。

對培養(yǎng)基的成分和鹽類的濃度應(yīng)保持相對穩(wěn)定，不應(yīng)任意改變，如綠膿桿菌對青大霉素的敏感試驗受鈣、鎂離子的影響很大，Mueller-Hinton瓊脂，基本上不含拮抗物質(zhì)，食欲大多數(shù)病原菌生長。

培養(yǎng)基的厚度應(yīng)為4mm，抑菌環(huán)薄大而厚小，平皿應(yīng)放平澆注、平皿直徑應(yīng)為9-10cm，澆注培養(yǎng)基應(yīng)為25毫升。瓊脂的濃度一般應(yīng)為1.3-1.7%核實(shí)，對抑菌環(huán)無影。PH應(yīng)為7.2-7.4，偏酸偏堿對抗菌素的抑菌環(huán)物影響。培養(yǎng)基不應(yīng)加單糖類以免產(chǎn)酸。培養(yǎng)基保存在2-3℃可用一周，成分濃縮，硬度增加等，均不利于細(xì)菌生長和擴(kuò)散，培養(yǎng)基應(yīng)等滲，對營養(yǎng)要求高的細(xì)菌，如鏈球菌、肺炎鏈球菌可加入5%羊、兔血等脫纖維血。

2、倍檢菌種量的因素 是中藥的影響因素之一。細(xì)菌接種量大，抑菌環(huán)小，菌量過少，抑菌環(huán)相對增大，Waterwrth建議，近融合、半融合生長為宜，被檢菌稀釋濃度的簡易方法有三種；

(1)浸沒法（Flooding法） 取菌落在2毫升蛋白胨水中制成懸液，加在另一支2毫升蛋白胨水中混勻，用滴管吸取菌浸沒培養(yǎng)基，再將多余的菌懸液吸出。

（2）涂抹法（Barry 氏方法之一） 挑取被檢菌菌落，轉(zhuǎn)入無菌肉湯35-37℃培養(yǎng)4-6小時（或轉(zhuǎn)大量菌懸液不孵育），菌液相當(dāng)K-B濁度管0.5號濃度，肉眼比濁，菌液制備15分鐘后用拭子浸沾菌液，將多余的菌液在試管上擠去，然后在平皿旋轉(zhuǎn)60度角涂三次。

（3）重層法（Barry方法之二）挑取被檢菌落4-5個轉(zhuǎn)入0.5毫升腦心浸液肉湯中，于35-37℃，孵育4-5小時，達(dá)到/ml，可保持?jǐn)?shù)小時穩(wěn)定，用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)，挑取1微升加入9毫升并冷至50℃的1.5%瓊脂MH培養(yǎng)基中，充分混合，重層于已備好的直徑15cm藥敏試驗用MH瓶培養(yǎng)基表面，若為9cm培養(yǎng)皿需含菌瓊脂2毫升。

上訴各種發(fā)放均需開蓋，室溫?zé)o菌放置10-15分鐘使水蒸發(fā)后貼紙片。

藥敏紙片的因素

1、為對藥敏實(shí)驗的質(zhì)量控制，應(yīng)由檢驗中心統(tǒng)一制備紙片，用標(biāo)準(zhǔn)菌株做重復(fù)性實(shí)驗，各紙片抑菌環(huán)直徑相差不應(yīng)＞1-1.5mm，紙片應(yīng)含等量定量的藥物，冷風(fēng)吹干，不要在37℃溫箱中烘干，以免有些青霉素敏感度下降。

2、紙片藥物的含量對藥敏結(jié)果的影響，紙片藥物的含量是根據(jù)常規(guī)投藥量和該藥物的MIC來確定的，最是含量，能使不同敏感度的菌株抑菌環(huán)明顯區(qū)分開，一般可按權(quán)威單位的推薦含量及出售廠商指定含量，根據(jù)MIC或服藥后血清殺菌試劑或許晴含藥濃度。

3、紙片保存不當(dāng)?shù)挠绊�，一般保存一個月以上（密閉），可由不同程度的下降，低溫干燥條件下4℃缸內(nèi)保存時間長，取出后1小時貼上，開蓋過早，空氣中水蒸氣進(jìn)入收場音響藥敏。

下圖為粘質(zhì)沙雷氏菌對青霉素G0.00020ug/ml敏感變化情況，在37℃培養(yǎng)實(shí)驗中，80%相對溫度條件下30天后，幾乎完全失效。

（4）藥敏紙片的貼附、孵育時間和判斷時間不當(dāng)對藥敏實(shí)驗的影響，在9cm平皿培養(yǎng)基上貼7張，紙片間距＞1.5cm，兩片中心相聚＞24mm。貼后不移動，15分鐘后放入35-37溫箱中18-24小時判讀結(jié)果。

     抑菌環(huán)一SIR為分界點(diǎn)，國內(nèi)不論藥物種類或被檢菌相同與否，以抑菌環(huán)直徑＞15mm為敏感（s），10-15mm中毒敏感（I)，＜10mm為耐藥（R)。

除上述的各項影響因素進(jìn)行質(zhì)控，應(yīng)嚴(yán)格遵守執(zhí)行外，還要注意下列幾個問題。

1、抗菌素的選擇，應(yīng)曬糧選定集中，按檢查的菌種而取首選藥物，如有耐藥則另換，因為存在價差耐藥為題，每類抗菌應(yīng)選一種為代表，使臨床醫(yī)師有所了解。

2、紙片擴(kuò)散使用于生長快的細(xì)菌，18-24小時孵育做終點(diǎn)讀取結(jié)果，生長慢的細(xì)菌如甲型溶血性鏈球菌等應(yīng)超過24小時觀察結(jié)果。

3、報告方式；應(yīng)報告敏感和耐藥的抗菌藥物，供臨床醫(yī)師選用，有敏感的抗菌藥物，即不應(yīng)寶中毒敏感的抗菌藥物，中毒可做緩沖地帶以減少藥敏實(shí)驗的誤差。

4、紙片擴(kuò)散一般應(yīng)用平皿固體MH培養(yǎng)基，鏈球菌、腸球菌需加血，流感嗜血桿菌需用巧克力培養(yǎng)基。

5、不能再CO2環(huán)境中孵育，以免使瓊脂表面PH受影響(PH降低）。

擴(kuò)散試驗誤差的原因

實(shí)驗條件和技術(shù)上的誤差，對藥敏實(shí)驗的準(zhǔn)確性影響很大，并且一種誤差可能包含另一種誤差，下面是遇到過的一些原因：

1、沒使用MH培養(yǎng)基。

2、MH培養(yǎng)基制備不當(dāng)，特別是PH調(diào)整不準(zhǔn)。

3、使用過期和不當(dāng)儲存的培養(yǎng)基。

4、藥敏紙片制作或保存不當(dāng)。

5、菌液濃度不準(zhǔn)。

6、比濁管制備和儲存不當(dāng)和過久。

7、接種時棉拭中過多的菌液沒壓出。

8、未及時將細(xì)菌接種于培養(yǎng)基平皿上。

9、接種后沒及時貼附藥敏紙片。

10、貼敷后沒及時孵育。

11、唯獨(dú)偏離35℃或大氣中CO2含量過高。

12、時間不粗18-24小時，提前讀取結(jié)果。

13、抑菌環(huán)量取不準(zhǔn)確。

14、接種培養(yǎng)物使混合菌。

15、接種培養(yǎng)物使生長慢的細(xì)菌或厭氧菌，。

16、沒有質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株對照。

17、沒能正確的將被建軍抑菌環(huán)轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的S、I、R.

原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司