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脯氨酸(PRO)含量測定試劑盒說明書

點(diǎn)擊次數(shù):1575 日期:2016/5/3 8:52:04

                                                                               分光光度法 50 管/48 樣
 
測定意義:
 
    Pro 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,逆境條件下,植物體內(nèi) Pro 含量顯著增 加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性,抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此, 脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。
 
測定原理:
 
    用磺基水楊酸SA提取 Pro,加熱處理后,Pro 與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色;加甲苯 萃取后,520nm 測定吸光度。
 
需自備的儀器和用品:
 
     可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、 甲苯 50mL、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
 
提取液液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一冰乙酸 25 mL×1 瓶, 4℃保存。自備 試劑二液體 25 mL×1 瓶, 4℃保存。
試劑三甲苯 50mL×1 瓶,4℃保存。自備
 
樣品測定的準(zhǔn)備:
 
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量104 個):提取液體積mL500~10001 的比例建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液), 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞冰浴,功率 20200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);之后 置沸水浴振蕩提取 10min;10000g,常溫離心 10min,取上清,冷卻后待測。 組織按照組織質(zhì)量g):提取液體積(mL)15~10 的比例建議稱取約 0.1g 組織,加 入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿;之后置沸水浴振蕩提取 10min;10000g,常溫離心 10min 取上清,冷卻后待測。
2、血清漿樣品按照血清漿體積mL):提取液體積(mL) 15~10 的比例 議取 0.1mL 血清漿加入 1mL 提取液),充分混勻之后置沸水浴振蕩提取 10 分鐘,10000g, 常溫離心 10 分鐘,取上清,冷卻后待測。
測定步驟:
 
1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 520nm蒸餾水調(diào)零。 2、樣本測定
 
(1) 0.5mL 樣本+0.5mL 試劑一+0.5mL 試劑二于有蓋試管中,置沸水浴中保溫 30min
 
,防止水分散失),10min 振蕩一次。
 
(2)待冷卻后,在試管中加入 1mL 試劑三,振蕩 30s,靜置片刻,使色素轉(zhuǎn)至試劑三中; 0.8mL-1mL 上層溶液于 1mL 玻璃比色皿中520nm 波長處比色,記錄吸光值 A。
Pro 含量計算
 
1、典型回歸方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 為脯氨酸含量,μg/mLy 為吸光值 A) 2、按照血清漿體積計算
 
Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2=192×(A+0.0021) 3、按照蛋白濃度計算
 
Pro (μg/mgprot)=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr 4、按照樣本質(zhì)量計算
Pro 含量(µg/g )=[(A+0.0021)÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021)÷W 5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
Pro 含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021) V1加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.5mL;V2加入提取液體積,1 mL;V3加入血清漿 體積0.1 mL;Cpr樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W樣本質(zhì)量,g;500細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
    來源于青島青島捷世康:www.tennis-video.com

原創(chuàng)作者:青島捷世康生物科技有限公司

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