ELISA 試劑盒的組成
在酶聯(lián)免疫吸附法中3個(gè)必要的條件，就是已經(jīng)包被過的板，酶結(jié)合物和底物，ELISA還需要包被抗原或抗體的微孔板、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、酶結(jié)合物、底物及標(biāo)本的稀釋液和反應(yīng)終止液等試劑。所使用的材料主要指固相載體-微孔板。
一 固相載體
可作為ELISA固相載體的物質(zhì)很多，例如聚乙烯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、玻璃和硅橡膠等、但現(xiàn)已不多用。理想的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好、空白值低、透明度高、隔空的大小和性能相同。目前最常用的是聚苯乙烯、他有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能、并且不損害蛋白質(zhì)的免疫活性，不行影響ELISA過程中的免疫反應(yīng)和顯色反應(yīng)，價(jià)格低廉，來源容易，因此被普遍采用
二 固相載體的特征
ELISA再提的形狀主要有3種：微量滴定板、小珠、小試管。以微量滴定板為常用，專用ELISA的產(chǎn)品成為ELISA板，國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8*12的96孔式。為便于做少量標(biāo)本的檢測(cè)有制成8連孔條12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板特顯是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可以在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果�，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定版型的ELISA檢測(cè)。包括加樣、洗滌、保溫、比色步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化紀(jì)委有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸收性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使股向上抗體量增多，但用于間接法測(cè)定抗體時(shí)空白值較大良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，隔板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，因此每一批號(hào)的ELISA板在使用前需要事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止反應(yīng)后，分別測(cè)每孔溶液的吸光度�？刂品磻�(yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀書的均讀數(shù)之差，應(yīng)小于10%。
余聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體聚氯乙烯的特點(diǎn)是質(zhì)軟板薄，可剪切，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋白的吸附性能比聚苯乙烯高但空白值液略高。
為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的實(shí)驗(yàn)，用其他免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將他們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上預(yù)訂的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果差別大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定項(xiàng)目中最合適的固相載體。、
在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑為0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。吸附面積的增大意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球形小珠的表面弧度更有利于媳婦的抗原決定粗或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀體，因此珠式ELISA的放映往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更容易洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好，但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試管敏感性的提高。小試管還可以做比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比色。
也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成顆粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面積較大，反映在懸浮中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以寒鐵的磁性顆粒為ELISA固相載體，反應(yīng)后磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。
三 包被的方式
將抗原或抗體固定的過程叫包被。換言之，包被既是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子機(jī)構(gòu)上疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的媳婦是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，更容易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等故鄉(xiāng)具有較強(qiáng)的吸附能力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴漏于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多可以采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴漏，在這種情況下，直接寶貝效果不佳，可以采用間接的補(bǔ)貨包被法，即先將針對(duì)該抗原的特異抗體做預(yù)包被，氣候通過抗原抗體放映使抗原固相化。此間接結(jié)合在股向上的抗原原理載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴漏。間接寶貝的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)量較多的抗原也可采用補(bǔ)貨包被法，實(shí)驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，因?yàn)橹苯影坏?/10甚至更少。不易吸付在聚苯乙烯載體上的份蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式，例如在檢測(cè)抗DNA抗體時(shí)，需要DNA作為包被抗原，而普通的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合�？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉�(jīng)過紫外線照射，以增加其吸附性能。固相載體先用先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等做預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合能力。液作用親和素系統(tǒng)做間接寶貝，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種方法均勻，牢固，以擴(kuò)大大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。
脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置于冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，帶酒精揮發(fā)后，讓脂類自然干固在固相表面�？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式
四 包被用抗原
用于包被固相載體的抗原按來源分為天然抗原，重組抗原和合成多肽抗原3大類
天然抗原可曲子動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能做包被用。如HB-sAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成分抗原可從富含此抗原的材料中提取
重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為智力題。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成分外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，單純化技術(shù)難度較大。一大腸桿菌為智力題的重組抗原如不能充分去除大腸桿菌成分，用于ELISA，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽(yáng)性。因不少受檢著受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測(cè)抗HCV ELISA中作用寶貝抗原大多為根據(jù)HCV的基因可控表達(dá)而制備的重組抗體。在傳染病診斷中，不少重組抗原HBsAg、HBeAg、HIV抗原均在ELISA中取得應(yīng)用。
合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的莫伊抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。脫胎抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高。但由于分子量太小，往往難于直接洗孵育固相上。多肽抗原的包被一般需要先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白至等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，簡(jiǎn)介的結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為它僅能檢測(cè)語(yǔ)氣相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體昌盛的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原放生反應(yīng)。另外，默寫微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)的變化，在這種情況下用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗原的漏檢。
五 包被用抗體
包被固相載體的的抗體應(yīng)具有較高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單可克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì).在抗徐慶忠將出現(xiàn)雜抗體，必須去除后才能用ELISA，以保證實(shí)驗(yàn)的特異性�？寡宀荒苤苯佑糜诎�，影響提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和SEPHADEX凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析出提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性能不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高實(shí)驗(yàn)的敏感性，則可采用親和層析法一出去康徐慶忠含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性較強(qiáng)，因此不需要做吸收和親和層析處理。一般講腹水做適當(dāng)稀釋后直接寶貝，必要時(shí)也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意，一種單抗僅針對(duì)一種抗原決定簇，在某種情況下，用多種抗單混合包被，可取得更好效果。
六 包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度、包被的溫度和時(shí)間、包被液的PH值等應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也用ph值為7.2的梨酸鹽緩沖液通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8攝氏度冰箱中放置過夜，37℃中保存2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ul/ml
七 封閉
封閉是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液在寶貝的過程�？乖蚩贵w包被時(shí)所用濃度較低，吸收后固相載體表面尚有違背占據(jù)的空隙，封閉就是 讓大量不想關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%明教作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)做封閉劑使用，但由于奶粉的成分復(fù)雜，而且封閉后載體不易長(zhǎng)期保存次芳芳較少應(yīng)用。
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需要封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高，一般來說，雙抗夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是單抗腹水直接包被時(shí)。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。
原創(chuàng)作者：青島捷世康生物科技有限公司
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