細胞內(nèi)pH
細胞內(nèi)pH、膜電位和細胞內(nèi)鈣都是細胞激活過程中重要的細胞參量。實驗表明：外源凝集素刺激淋巴細胞后幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)細胞內(nèi)pH值的增加。流式細胞術多參量（DNA和pH）測量表明，細胞周期移行過程中，增殖期細胞比靜止期細胞更偏堿性。此外，實驗還證明，實體瘤中有一些區(qū)域，它們中的pH值顯著低于正常組織，可能是由于這些細胞缺氧產(chǎn)生乳酸所造成。
流式細胞術中采用的pH熒光探針很多，較常用的有BCECF（2’7’-bis（Carboxyethyl）-5,6-Carboxy Fluorescein，2’7’二羧乙基-5,6羧基熒光素）和6-COFDA（6-Carboxy Fluorescein Diacetate，6-羧基二醋酸酯熒光素），這兩種pH熒光探針都是熒光素的衍生物。還有DCH（2,3-Dicyano-hydrochinone，2,3二氰基氫醌）以及SNARF系列（Seminaphthorhodafluor）和SNAFL系列（Seminaphthof-luorescein）pH指示劑。
BCECF的激光光譜是pH依賴性的，在低pH環(huán)境中激發(fā)峰為450nm，高pH環(huán)境中激發(fā)峰為500nm，其發(fā)射峰對pH不敏感，約為530nm。用BCECF測量細胞內(nèi)pH采用比例法，即分別用500nm和450nm激發(fā)BCECF所得到的530nm發(fā)射熒光之比。在生理pH有很好的線性關系，被估計的細胞內(nèi)pH的最大分辨率為0.4pH單位。用比例熒光測量pH的好處是，測量值不受染料進入細胞多少、細胞的厚度、光猝滅情況以及染料漏出等影響。試驗中BCECF比例熒光與pH的關系必須被校準。作校準曲線的方法是：將細胞與已知pH值并加有質(zhì)子載體尼日利亞菌素（nigericin）的緩沖液達到平衡后，對應幾組不同pH值的緩沖液，分別測出熒光發(fā)射的比例，可以獲得pH校準曲線。質(zhì)子載體的作用是能轉(zhuǎn)運質(zhì)子通過細胞膜，使膜內(nèi)外pH值相等。此外應注意校準曲線是與測量儀器、所用染料有關系的，必須嚴格控制作標準曲線時和實驗時各種條件的一致性。
BCECF不能直接進入細胞，通過它的乙酰甲酯（aceto-xymethyl ester）BCECF-AM能夠進入細胞中，在細胞內(nèi)被酯酶水解后，釋放出BCECF分子。BCECF在細胞內(nèi)不進入線粒體和其它酸性室如溶酶體，只限于胞漿中，所以測的是細胞質(zhì)pH。
BCECF對于多數(shù)細胞滯留性好，不容易從細胞中漏出來。如果用BCECF-AM標記細胞后，
重新懸浮在緩沖液中，在4℃，兩小時內(nèi)染料仍有95%滯留于細胞中，所以背景熒光低，信噪比大�？傊�，由于BCECF能夠估計將近2單位的pH值，熒光僅限于胞漿內(nèi)并且較穩(wěn)定等特性，使它成為較常用的pH熒光探針。
COFDA的光譜特性與BCECF類似，低pH下激發(fā)峰為450nm，高pH下激發(fā)峰為495nm，發(fā)射峰約為520nm。比例測量是分別以495nm和450nm激發(fā)COFDA所得到的520nm發(fā)射熒光的比例。
COFDA是通過二醋酸酯導入細胞中，在細胞內(nèi)被酯酶水解后，釋放出羧基熒光素分子，由于它不進入線粒體中，所以可以估計細胞漿pH值，此外COFDA在細胞內(nèi)滯留特性也較好。
DCH熒光對pH值有很強的依賴性。DCH通過它的酯ADB（1，4-diacetoxy-2,3-dicyano-benzene）進入細胞，然后被酯酶水解成為DCH。DCH在細胞中的分布，約有10%的染料進入細胞器中。當pH為6—7.6時，溶液中的DCH激發(fā)峰為350nm，發(fā)射峰為460nm。比例法測量為：紫外光激發(fā)，測量熒光發(fā)射425/540nm的比例；所得結果可以估計pH值為6—7.6的范圍，分辨率可達0.2pH單位。DCH標記細胞后10分鐘，熒光達到最強，隨后染料逐漸漏失，在4℃染色30分鐘后，約漏掉50%的染料，染色后10—30分鐘內(nèi)，熒光比例是穩(wěn)定的，可進行流式測量。
近年來又合成了一些新的細胞內(nèi)pH熒光探針，例如SNARF和SNAFL系列pH熒光探針，這類探針對于測量6.3—8.6范圍的pH值是很有用的。他們有兩個發(fā)射峰，在酸性溶液中發(fā)黃色或橙色熒光，在堿性溶液中發(fā)紅色熒光。由于其間有一個不依賴于pH值的等發(fā)射點，故可采用以同一激發(fā)波長激發(fā)樣品，測量兩個發(fā)射峰比例的方法。這類探針的另一特點是其吸收光譜也依賴于pH而變化，所以也可采用以兩個激發(fā)波長激發(fā)樣品，測量同一發(fā)射熒光的激發(fā)比例法�？筛鶕�(jù)儀器條件，選擇一種比例法測量細胞內(nèi)pH值。測量前，必須作pH值與比例值之間的校正曲線。由于這類染料適于較長波長激發(fā)，所以可用氬離子激光器激發(fā)。
SNARF和SNAFL的乙酰甲酯SNARF-AM和SNAFL-AM很容易通過膜進入細胞中，并且比羧基熒光素在細胞內(nèi)的滯留性能好，是一種很有前途的pH熒光探針。使用時，先以1nM的濃度溶在干燥的DMSO中（放熱防潮），使用前立即用緩沖液稀釋貯液，標記細胞的終濃度為1—5uM。
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