硝酸還原酶(NR)檢測試劑盒(萘胺比色法)
產(chǎn)品簡介：
硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)是一種氧化還原酶，可分為參與硝酸鹽同化的同
化型還原酶和催化以硝酸鹽為活體氧化的最終電子受休的硝酸鹽呼吸異化型(呼吸型)還原酶。硝酸還原酶是植物氮素代謝中氮素同化的關(guān)鍵酶，該酶與作物吸收利用氮肥有關(guān)，對作物的產(chǎn)量和質(zhì)量有影響，因此可以把硝酸還原酶的活力當(dāng)作營養(yǎng)診斷養(yǎng)、農(nóng)田施肥或作物育種的生理生化指標(biāo)。
硝酸還原酶(NR)檢測試劑盒(萘胺比色法)檢測原理是 NR 催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，其反應(yīng)如下：
NO3-+NADH+H+→NO2-+NAD++H2O
產(chǎn)生的亞硝酸鹽與磺胺、萘胺在酸性條件下定量生成穩(wěn)定的紅色偶氮化合物，于分光光
度計(jì) 520nm 處檢測吸光度，以吸光度變化所需萘胺進(jìn)行計(jì)算。該試劑盒主要用于檢測植物
樣本、血清等中硝酸還原酶活性，尤其適用于植物體內(nèi)硝酸還原酶的活力。該試劑盒僅用于
科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途.
產(chǎn)品組成：
 編號名稱 | 50T | 100T | Storage |
| 試劑(A):亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)(100μg/ml) | 1ml | 1ml | 4℃ |
| 試劑(B): NR Lysis buffer | 250ml | 500ml | RT |
| 試劑(C): NR Assay buffer | 30ml | 50ml | RT |
| 試劑(D):硝酸鹽緩沖液 | 35ml | 50ml | RT |
| 試劑(E): NADH | 2支 | 3支 | -20℃ |
| 試劑(F): NR 終止液 | 30ml | 60ml | RT避光 |
| 試劑(G):萘胺顯色液 | 30ml | 60ml | RT避光 |
| 使用說明書 | 1 份 |
自備材料：
1、蒸餾水
2、離心管或試管
3、勻漿器或研缽
4、恒溫箱或水浴鍋
5、低溫離心機(jī)
6、比色杯
7、分光光度計(jì)
操作步驟(僅供參考)：
1、準(zhǔn)備樣品：
①植物樣品：取0.25g植物組織(根系)清洗干凈，切碎，置于-20℃冰箱
30min。按植物組織：NR Lysis buffer=0.25g：2ml 的比例，加入預(yù)冷的NR Lysis
buffer，冰浴情況下充分勻漿或研磨。4000g，4℃離心15-20min，留取上清液
即為硝酸還原酶粗提液，4℃保存待用。
②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試
劑盒的測定，-20℃凍存，用于硝酸還原酶的測定。
③高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的硝酸還原酶，可以使用NR Lysis
buffer 進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>
2、稀釋系列亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)：取適量的亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)(100μg/ml)，按亞硝態(tài)氮標(biāo)
準(zhǔn)(100μg/ml)：蒸餾水=1：99的比例混合，即獲得亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)(1μg/ml)，
然后按下表進(jìn)行稀釋：
| 加入物(ml) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)(μg/ml) | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
| 蒸餾水 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 每管亞硝態(tài)氮含量(μg) | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1 |
3、配制 NADH 工作液：取 1 支 NADH，恢復(fù)至室溫，完全溶解于 10ml NR Assay buffer，即得 NADH 工作液。4℃預(yù)冷備用，-20℃保存 1 周有效。
4、NR 加樣：按照下表設(shè)置空白管、對照管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的酶活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定，樣品的檢測最好能設(shè)置 2 平行管，求平均值。
| 加入物(ml) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 對照管 | 測定管 |
| NR Assay buffer | - | - | 0.2 | - |
| 系列亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)(1-6 號管) | - | 1 | - | - |
| 硝酸還原酶粗提液 | - | - | - | 0.2 |
| 蒸餾水 | 1 | - | - | - |
| 硝酸鹽緩沖液 | - | - | 0.6 | 0.6 |
| NADH 工作液 | - | - | 0.2 | 0.2 |
| 混勻，25℃孵育 30min，立即加入 NR 終止液。 |
| NR 終止液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 萘胺顯色液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
5、繪制亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線：比色杯光徑 1.0cm，以空白管調(diào)零，以分光光度計(jì)測定 520nm
處系列標(biāo)準(zhǔn)管(1-6 號)吸光度。以 1-6 號亞硝態(tài)氮含量(μg)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐
標(biāo)，繪制亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6、NR 測定：對照管、測定管顯色 15min 后， 4℃ 4000g 離心 15min，取上清液待用。
比色杯光徑 1.0cm，以對照管調(diào)零，以分光光度計(jì)測定 520nm 處測定管吸光度。
計(jì)算：
以亞硝態(tài)氮含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)亞硝態(tài)氮
含量與吸光度關(guān)系直接計(jì)算回歸方程，根據(jù)回歸方程計(jì)算出反應(yīng)體系中亞硝態(tài)氮含量。按下
公式計(jì)算樣品中的 NR 活性：
NR(μg/g·h)=X×V1/(W×t×V2)
式中：X=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶粗提液中亞硝態(tài)氮含量(μg)
V1=提取酶液時加入的緩沖液體積(ml)=4
W=植物新鮮重量(g)
t=孵育時間(h)=0.5
V2=加樣時加入的提取酶液體積(ml)=0.2
注意事項(xiàng)：
1、 硝酸還原酶容易失活，提取和測定時均應(yīng)操作迅速，盡量在 4℃操作。
2、 如果測定植物樣本，取樣最好在晴天進(jìn)行，最好提前一天施些硝態(tài)氮肥，取樣部位應(yīng)一致。
3、 加入 NADH 工作液后，應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，以防亞硝酸鹽還原為氨。
4、 顯色和比色時間應(yīng)一致，顯色時間過長或過短對顏色都有影響。
5、 如果沒有分光光度計(jì)，也可以使用普通的酶標(biāo)儀測定，但應(yīng)注意酶標(biāo)板每孔的最小測定體積。
6、 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
有效期：6 個月有效。
技術(shù)支持: