巨細(xì)胞病毒抗原的制備及在Elisa中的應(yīng)用

巨細(xì)胞病毒（CMV)感染能對(duì)嬰兒和器官移植手術(shù)后病人造成很大危害，為尋找快速，敏感的檢測(cè)方法，及時(shí)對(duì)感染作出診斷，我們制備出供E.LISA用的CMV凍化及甘氨酸提取抗原。

抗原制備：凍化抗原制備：用AD-169株病毒感染人胚肺二倍體細(xì)胞（2BS）株，病變到80%以上時(shí)，倒掉細(xì)胞維持液，加入一定量PH7.2磷酸緩沖鹽水，反復(fù)凍化三次，離心后上清液即為抗原，甘氨酸提取抗原制備：感染細(xì)胞方法同上，當(dāng)病變達(dá)80%以上時(shí)，倒掉細(xì)胞維持液，加入一定量PH7.2磷酸緩沖鹽水，倒點(diǎn)細(xì)胞維持液，每克氏瓶加入ph9.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖鹽水7.0ml，掛掉細(xì)胞，超聲波處理后，3000rpm離心15分鐘，上清液即為試驗(yàn)用抗原，凍化及甘氨酸提取抗原的對(duì)照抗原用同一方法制備，但使用未感染病毒的正常2BS細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)的參考抗原為美國(guó)產(chǎn)AD-169株凍化抗原3--101J及正常細(xì)胞對(duì)照抗原3--102.

血清標(biāo)本：為北京地區(qū)獻(xiàn)血員及孕婦的血清。

ELISA間接法測(cè)定血清CMV特異性抗體：凍化和甘氨酸提取及參考抗原30-101J分別用PH9.6的碳酸鹽緩沖液1:50及1:100稀釋，包被40孔聚苯乙烯塑料板（上海市塑料三場(chǎng)），每孔0.1ml，置4℃過(guò)夜，三種抗原的正常細(xì)胞對(duì)照抗原用相同發(fā)發(fā)稀釋及包被塑料板。待檢血清1:50起做4倍稀釋，每個(gè)稀釋度許晴分別為加2個(gè)抗原及正常細(xì)胞對(duì)照抗原，實(shí)驗(yàn)操作方法按文獻(xiàn)，結(jié)合物為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgG，底物為鄰苯二胺，在492nm讀取OD值，以待血清OD值比陰性對(duì)照高2倍的血清稀釋度為重點(diǎn)低度。

CMV凍化及甘氨酸提取抗原用于ELISA法檢測(cè)人血清特異性IgG抗體比較：152份健康成人血清隨意分成3組，分別用我們制備的凍化及甘氨酸提取抗原與參考抗原30-101J檢測(cè)血清CMV特異性IgG抗體，結(jié)果見表。

三種抗原測(cè)定血清CMV特異性IgG抗體結(jié)果

從表可見，凍化及甘氨酸提取抗原與參考抗原3--101J檢測(cè)血清，CMB特異性抗體結(jié)果科比。三種抗原同時(shí)測(cè)定同一地區(qū)相同條件下的人群CMV特異性IgG抗體的陽(yáng)性率是一致的，凍化抗原為94.4%;甘氨酸提取抗原為91.3%；參考抗原30-101J為94.2%；抗體滴度分布已很一致，抗體滴度介于1:800-1:3200的百分率，凍化抗原為61.1%；甘氨酸提取抗原為56.5%；從圖一可見三種抗原測(cè)定血清CMV特異性IgG抗體時(shí)，抗體滴度分布是一致的。

由于做補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，甘氨酸提取抗原的敏感性明顯高于凍化抗原，krishna等。也指出0.1M甘氨酸-NaOH-0.1M NaCL緩沖鹽水提取的抗原測(cè)定人許晴CMV特異性IgG和IgM抗體，獲得有意義的結(jié)果。考慮到同一種抗原用于集中不同實(shí)驗(yàn)中的方便性，我們進(jìn)一步用甘氨酸提取抗原及參考抗原30-101J在同一試驗(yàn)條件下，測(cè)定55份北京地區(qū)孕婦許晴中CMV特異性IgG抗體，兩種抗原測(cè)得的抗體滴度的相關(guān)性結(jié)果見表2

從圖2中可見55份孕婦血清，用2中抗原，同時(shí)測(cè)定CMV特異性IgG抗體，每份血清抗體的對(duì)滴度相當(dāng)一致。滴度完全一致的有42份，占總血清數(shù)的76.3%；其余13份許晴滴度雖不一致，但相差值一個(gè)許晴稀釋度。

我們?cè)�用高速離心方法提純濃縮病毒，這樣制備的抗原用elisa法測(cè)定血清CMV特異性抗體時(shí)，結(jié)果與參考抗原390-101J一致，但制備抗原需高速離心機(jī)等設(shè)備，而凍化抗原制備方法簡(jiǎn)便，適用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)及ELISA試驗(yàn)，則更具有推廣使用價(jià)值。