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萘醌類化合物的生產(chǎn)工藝(標(biāo)準(zhǔn)品)

點(diǎn)擊次數(shù):1118 日期:2015/9/11 13:54:24

萘醌類化合物的生產(chǎn)工藝(標(biāo)準(zhǔn)品

從化學(xué)結(jié)構(gòu)而言,其他脂類化合物主要有泛醌類的輔酶Q10和萘醌類的紫草素。紫草素具有顯著的抗生育、抗炎、抗腫瘤、殺菌抗病毒、保肝和免疫調(diào)節(jié)等作用。由于紫草野生資源較少,難于人工訓(xùn)話培養(yǎng),大量采挖勢(shì)必造成資源枯竭及生態(tài)環(huán)境的破壞,借助植物細(xì)胞可避免由于過(guò)量采伐造成的生態(tài)環(huán)境的破壞。20試劑70-80年代,日本學(xué)者Tabata等最早成功誘導(dǎo)處硬紫草的愈傷組織,并影響紫草寧及其衍生物產(chǎn)量的條件進(jìn)行了研究。80年代后期,我國(guó)學(xué)者也對(duì)紫草的組織培養(yǎng)進(jìn)行了多方面的研究。目前,紫草素主要通過(guò)植物材料提取和組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行工業(yè)化的生產(chǎn)。

萘醌
愈傷組織誘導(dǎo)

將紫草成熟種子置于含有萘醌mol/L 2,4-D和標(biāo)準(zhǔn)品mol/L 激動(dòng)素的LS瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂1%)上,一直在黑暗、25℃下培養(yǎng)。種子萌發(fā)后于幼根部形成愈傷組織,再將此愈傷組織移植至含標(biāo)準(zhǔn)品mol/L IAA和標(biāo)準(zhǔn)品mol/L激動(dòng)素LS瓊脂培養(yǎng)基中。

繼代培養(yǎng)

將獲得的1.5g鮮重愈傷組織移入裝有80mL含有標(biāo)準(zhǔn)品mol/L IAA和標(biāo)準(zhǔn)品mol/L激動(dòng)素LS液體培養(yǎng)基的300mL 三角瓶中,在100r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng),使細(xì)胞增殖。培養(yǎng)初起由于瓊脂培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生紫草素易變質(zhì),細(xì)胞外觀及不均一,但經(jīng)14d培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基后,生長(zhǎng)迅速的白色細(xì)胞大量繁殖,以后每隔14d移入新鮮培養(yǎng)基,經(jīng)2-3代培養(yǎng)后,即可獲得均一的細(xì)胞團(tuán)。這樣均一的細(xì)胞團(tuán)經(jīng)14d培養(yǎng)后增加約13倍。細(xì)胞移植時(shí),用不銹鋼制孔徑40um的篩網(wǎng)手機(jī)細(xì)胞,按80mL培養(yǎng)基加1.5g鮮重細(xì)胞的比例進(jìn)行接種。

一級(jí)培養(yǎng)(細(xì)胞的增殖培養(yǎng))標(biāo)準(zhǔn)品

接種在LS培養(yǎng)基內(nèi)繼代培養(yǎng)14d后,用如前所述的方法手機(jī)細(xì)胞,將1.5g鮮重細(xì)胞接種在80mL IMG-5培養(yǎng)基中,進(jìn)行振蕩培養(yǎng),在細(xì)胞增加6-7倍后,自第10-11天掐對(duì)數(shù)增長(zhǎng)長(zhǎng)期結(jié)束,增殖速度開(kāi)始降低。生產(chǎn)紫草素的種細(xì)胞的生長(zhǎng)階段對(duì)第2階段在M-9培養(yǎng)基中的培養(yǎng)有很大影響。用對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞作為種細(xì)胞,紫草素的得率最高。因此,從細(xì)胞收獲量和紫草素生產(chǎn)考慮,在移植后的第9天結(jié)束第1階段最為合適。此外MG-5培養(yǎng)基不含植物激素,所以不能用于維持細(xì)胞株的繼代。

二級(jí)培養(yǎng)(生產(chǎn)紫草素的培養(yǎng))標(biāo)準(zhǔn)品

如前述方法手機(jī)以及培養(yǎng)所得細(xì)胞,將2.4g鮮重細(xì)胞移入裝有80mL M-9培養(yǎng)基300mL 三角瓶中,在100r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)。從培養(yǎng)第2天起,一部分細(xì)胞即呈紅色,至第7天全部細(xì)胞完全呈鮮紅色。經(jīng)14d培養(yǎng)的細(xì)胞中紫草素含量為15%,即1L培養(yǎng)基中紫草素的收獲量為15g.

產(chǎn)物的同步提取標(biāo)準(zhǔn)品

在培養(yǎng)過(guò)程中,細(xì)胞會(huì)將紫草素沖胞內(nèi)分泌到胞外,附著的細(xì)胞壁表面,影響細(xì)胞對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和紫草素的合成,因此,使用某些有機(jī)溶劑在培養(yǎng)過(guò)程中同步萃取紫草素,即簡(jiǎn)化了次生代謝物的分離提純工作,又降低了產(chǎn)物的反饋抑制。標(biāo)準(zhǔn)品在培養(yǎng)過(guò)程中添加維生素C,L-苯丙氨酸和正十六烷聚能提高紫草素產(chǎn)率,其中正十六烷效率最好,提高了5.8倍;加入0.12%的Tween-20.硬紫草細(xì)胞合成色素總產(chǎn)量達(dá)么可干細(xì)胞含18.15mg,比對(duì)照提高了4.2倍。另外,在培養(yǎng)過(guò)程中加入大孔吸附樹(shù)脂吸附紫草色素,可使色素的產(chǎn)量提高6倍。

固定化培養(yǎng)技術(shù)

固定化培養(yǎng)運(yùn)用于植物細(xì)胞已有幾十年的歷史,由于固定化技術(shù)可以反復(fù)利用細(xì)胞,增加細(xì)胞密度,大幅度提高有效成分的產(chǎn)量,目前,固定化培養(yǎng)議程為利用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生物質(zhì)研究的一個(gè)重要方向。吧硬紫草細(xì)胞包埋在海藻酸鈣中固定化培養(yǎng),30d后色素外泌達(dá)70%,而懸浮細(xì)胞僅有30%。如同時(shí)使用正十六烷進(jìn)行萃取,色素外泌可達(dá)95%。研究表明固定化培養(yǎng)過(guò)程中,45d更換一次培養(yǎng)基,則180d后,細(xì)胞仍有產(chǎn)生色素的能力。

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