流式細胞術(shù)的發(fā)展簡史
流式細胞術(shù)是對細胞或細胞器快速測量的高技術(shù)。依賴測量的參數(shù)，還可以用物理的方法將一個群體中的亞群分選出來，這就是流式細胞分選術(shù)。上述的“流式”，指的是在測量過程中細胞是流動的，不是靜止的，這是與在此以前對細胞測量技術(shù)的最大差異之處。流式細胞術(shù)目前在國內(nèi)的一些有關(guān)實驗室、醫(yī)院已發(fā)展成常規(guī)技術(shù)，在我國，經(jīng)過十年的推廣也逐漸普及。經(jīng)過數(shù)十年的努力，流式細胞術(shù)從一個只能計數(shù)，稍后可測粒子大小的儀器，發(fā)展到今天可快速定量測定同一個細胞的多種化學(xué)的和物理的特性，這中間凝集著許多人的心血，既有成功，也有失敗。
第一個報道自動計數(shù)細胞的是Moldavan（1934年），他描述了一個裝置：懸浮的血紅細胞或是用中性紅染色的酵母，在顯微鏡的載物臺上從一個毛細玻璃管中流動，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來。他注意到了一系列技術(shù)上的細節(jié)。但此后一直沒有進一步的報道。現(xiàn)在，人們都把這個實驗看成是有關(guān)流式細胞術(shù)的第一個嘗試。1941年，沒有什么更新的內(nèi)容。
通過這些實驗，人們發(fā)現(xiàn)，在流式細胞計細胞要流動的狹窄管道中存在的最大問題是大細胞或細胞團阻塞通道，為解決這個困難，人們不禁想起1883年Reynolds用來研究管子中層流時使用的鞘液原理。Gucker等人在1947年就是用這個原理和光電技術(shù)結(jié)合起來對氣溶膠中的粒子進行計數(shù)，隨后，Grosland-Taylor利用同一原理在1953年設(shè)計了一個流動室，用光學(xué)方法來計數(shù)血細胞。他讓懸浮的細胞慢慢地注入快速流動的液柱中，這個液柱外面被層流鞘液包圍著，粒子在軸心流動。這樣做有兩個好處：一是消除了大個顆粒阻塞現(xiàn)象；二是它可精確控制粒子進入液柱的位置，使之在軸心上，這樣就建立了流體動力聚焦的原理。今天，幾乎所有流式細胞術(shù)的液流原理都采用了上述技術(shù)。
1949年，Wallance Coultre申請了一個名叫“流動的懸浮粒子計數(shù)方法”的專利，在專利的方法中，他使粒子通過一個小孔。只要粒子與懸浮的介質(zhì)間在電導(dǎo)率上有差異，小孔中粒子的存在與否既能引起可檢測出的電特性變化，此現(xiàn)象通常這被稱為Coultre效應(yīng)，他在此基礎(chǔ)上生產(chǎn)了Coultre計數(shù)器（1956年）。此后，還有一些人發(fā)展了各種粒子測量設(shè)備，但原理上都差不多。其中Parker和Horst在1953年申請的專利“同時計數(shù)紅、白血細胞的方法”，是用稀釋的血細胞懸浮在等滲液中，白細胞染成藍色，紅細胞仍為紅色，細胞通過一根導(dǎo)管再被一束光照射，透射光被分成紅、藍兩個成分并分別送到光電池上，這樣就可記錄通過的細胞是吸收了藍光還是紅光。于是，不但記錄了通過的細胞數(shù)目，還識別了通過的細胞是白細胞還是紅細胞，這已經(jīng)有點今日流式細胞術(shù)的意思了。此后，直到60年代中期，流式細胞術(shù)始終無多大進展。
1965年，Kamentsky提出兩個新概念：一是用分光光度學(xué)定量測量細胞組分；另一個是細胞的不同組分可以被同時多參數(shù)測量，用以給細胞分類。最初曾用核酸的紫外吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色的細胞，測量的速度大約是每秒測500個細胞。他同時也是第一個用兩維直方圖顯示并分析多參數(shù)流式細胞術(shù)的人。他也是第一個用計算機接口到儀器上，記錄并分析多參數(shù)數(shù)據(jù)的人。他的這個裝置隨后改裝成商品儀器，商品名為Ortho Cytograph和Cytofluo rograph。
1968年，Dittrich和Gohde在英國申請了一個專利，名稱是“在分散體系中自動測量和計數(shù)粒子的裝置”。他們在測量粒子的熒光或磷光時，讓粒子平行于透鏡光軸的方向運動，并通過大數(shù)值孔徑物鏡的焦面，粒子通過焦面后再用一個沖洗液使之偏轉(zhuǎn)。該裝置使用了Kohler照明，因而在粒子運動的出口處可得到均勻的照明，這就免去了聚焦的問題。這樣一個設(shè)備可以用Kohler照明進行熒光的激發(fā)，也可以收集發(fā)射的熒光，光源使用氙燈或高壓汞燈。采用大的數(shù)值孔徑透鏡保證了激發(fā)光和收集發(fā)射光都有大的立體角，而較大的立體角又可在測量非對稱細胞時細胞不同的取向不致使信號發(fā)生變化。Gohde以很小的變異系數(shù)測量了細胞群體的DNA。按上述原理制成的商品名稱為Phywe lmpulscytopho-tometer簡稱ICP，隨后生成的ICO22，直到今天還有人仍在使用。
在1967年，Van Dilla和Los Alamos小組率先發(fā)展了一種液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)光軸三者互相垂直的流式細胞計。這種不依賴顯微鏡的設(shè)備采用了由Grosland-Taylor設(shè)計的層流流動室并使用氬離子激光器為照明光源。這種垂直相交的系統(tǒng)以后更進一步發(fā)展，除了可測熒光外還可測量散射光，后來還把Coulter計數(shù)器也安裝進去。他們第一個用熒光Feulgen反應(yīng)對細胞DNA染色，展示了DNA倍性和熒光間的線性關(guān)系，他們的DNA直方圖第一個清楚地顯示出細胞周期的G1時想、S時相，G1和M時相。他們第一個用同步培養(yǎng)的細胞論述了定量細胞動力學(xué)，而Gohde和Dittrich則是第一個用流式細胞術(shù)測量DNA以確定細胞周期變化來研究藥物影響細胞周期動力學(xué)的人。
至于流式細胞分選術(shù)，則首先是由Fulwyler在1965提出的，其改進型是在1969年。他使用了Sweet在1965年使用的一個靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)。這個技術(shù)原來裝在Coulter計數(shù)器上可使細胞按體積大小分類。與此同時，也是在1965年,Kamentsky獨立地申請了一個專利，這是一個在液流中經(jīng)過光度學(xué)或電學(xué)測量后分選細胞的方法。在此方法中利用了氣體動力學(xué)、水力學(xué)和靜電學(xué)的技術(shù)。后來Friedman曾設(shè)計過一個用液流開關(guān)分選的裝置，但較少使用，直到今天分選用的大部分仍然是電子學(xué)的方法，如Becton Dickinson公司的各種可供使用的FACS儀器仍然在應(yīng)用液滴偏轉(zhuǎn)的原理。
60年代和70年代，還有一些人在流式細胞術(shù)上做了不少的改進，有代表性的是Ehrlich和Wheeless。他們用飛點掃描技術(shù)或縫掃描技術(shù)得到了細胞形態(tài)學(xué)方面低分辨率的信息，從而改變了流式細胞術(shù)范疇的儀器都是零分辨率儀器的傳統(tǒng)觀點。
經(jīng)過上述一系列研究者的努力，到80年代，世界上流式細胞計的生產(chǎn)廠家已基本形成格局，在美國，以Becton-Dickinson公司和Coulter公司兩家為代表，各生產(chǎn)了一系列流式細胞計，B-D公司生產(chǎn)的流式細胞計都冠以FACS，其原文是Fluorescence Activated Cell Sorter，即熒光激活細胞分選器，現(xiàn)在具有代表的型號是FACScan和FACStar pluso Coulter公司生產(chǎn)的流式細胞計以Profile和EPICS 750為代表，最新產(chǎn)品還有EPICS Elite，但國內(nèi)尚未見到。以上產(chǎn)品的光源都是氬離子激光器。歐洲的產(chǎn)品可以瑞士的Partec公司為代表，型號為CIIL和PSAII，其產(chǎn)品都是在前述ICO基礎(chǔ)上發(fā)展的，故光源都使用了高壓汞燈，但最新推出的PASIII亦可安裝激光光源。國外除了上述三家外，西德、挪威，法國、日本等國亦有產(chǎn)品；我國上海第二醫(yī)學(xué)院和中國科學(xué)院生物物理研究所也先后研制成功，為國內(nèi)填補了一項空白。
進入80年代以來，流式細胞術(shù)在儀器本身方面似乎除了完善70年代提出的多光束、多站技術(shù)外進展不大。當(dāng)然，隨著計算機功能的提高，在數(shù)據(jù)存貯、顯示、分析方面日臻完善，人們的注意力逐漸集中到樣品制備方法，研制新的熒光染料，發(fā)展新的細胞特征標(biāo)記物等方面，這樣就開拓了一系列新的應(yīng)用。同時，儀器本身也就容易為一般研究者所掌握，也就更易普及。
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